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      1. 這是描述信息

        簡化基因組甲基化測序 (RRBS)

        項目介紹
        參數
        常見問題
        應用案例

         

        RRBS最高性價比甲基化檢測方案

         

        簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS),

        通過酶切富集啟動子及CpG 島區域,并進行Bisulfite 測序;

        作為最高性價比的甲基化研究方法,RRBS在大規模臨床樣本的研究中具有廣泛的應用;

        在經典RRBS基礎上,艾斯基因在國內首家推出強化版 RRBS,助力全基因組甲基化測序,

        可覆蓋全基因組范圍內超過6-9M個CpG 位點,>90%數量的CpG島及>85%數量的基因啟動子。

         

        核心技術質控,用心服務每一個項目

        艾斯團隊專注表觀組學10年,提供專業有價值的DNA甲基化完整解決方案;

        最早開發RRBS技術團隊之一, 國內首家推出強化版RRBS服務;

        已經完成人、哺乳動物及魚類等多個物種, 10000+例樣本項目經驗;

        嚴格的RRBS技術質控,MSPI酶切率>95%, Bisulfite轉化率>99%;

        自動化樣本處理、建庫及分析流程,保障高效周期,40天極速交付;

        低至10ng建庫,滿足穿刺、流式分選、微切等微量珍貴樣本的研究;

        核心團隊在Nature、Epigenetics、DNA Res等雜志發表多篇SCI論文;

        專業的生物信息分析團隊, 提供更多個性化分析思路和方案。

         

        科學方案設計

        從項目方案、樣本處理、建庫測序,到數據分析;

        每個項目需要專業、有價值的建議;及時高效的溝通,以保障高質量研究成果。

         

        樣本類型和要求

        樣本類型

        樣本要求

        基因組DNA

        總量≥ 1ug; 濃度≥ 30ng/ul; 完整性好; 基于Qubit定量

        細胞、全血、動物新鮮冷凍組織

        按照送樣要求準備

        備注1:不推薦FFPE、cfDNA等片段化樣本類型;

        備注2:不適合植物物種;

        備注2用封口膜密封樣品; 干冰運輸

         

         

        數據分析

        RRBS

        分析內容

        備注

        標準分析

        1、測序數據質量評估

        過濾掉低質量數據,保證數據質量

        2、與參考基因組比對

        比對率和覆蓋度分析

        3、MSPI酶切及Bisulfite轉化率質控

        MSPI酶切效率>95%; Bisulfite轉化率>99%

        4、甲基化位點Calling

        評估胞嘧啶甲基化狀態

        5、甲基化分布圖譜分析

        甲基化在基因組、功能元件上的分布

        6、組間差異甲基化DMR分析

        尋找DMR及注釋

        7、差異甲基化基因DMG分析

        DMG富集分析GO,KEGG

        8、多樣本聚類分析

        PCA分析多樣本甲基化變化規律

        高級分析

        9、多組學整合關聯分析

        例如與轉錄組關聯分析

        10、其它定制化分析

        結合課題背景亮點挖掘

         

        未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

         

        Q1:為什么RRBS是人和哺乳動物全基因組甲基化研究的首選方案?

        RRBS MspI 酶切將CpG 位點富集出來進行測序,人和哺乳動物基因組DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上;因此,RRBS是研究基因組CpG甲基化性價比最高的方案,檢測單堿基分辨率的高CG區域,僅需少量的DNA樣本和較低的成本而被廣泛使用。目前RRBS主要用于人、大小鼠、猴、豬、牛等哺乳動物,也常用于其他動物、鳥類及魚類等物種。

        下圖是經典的人和哺乳動物基因組甲基化特征:

        1、具有CpG島的基因啟動子區域,通常處于低甲基化狀態,基因間區、重復序列等非冗余區域,通常處于高甲基化狀態。

        2、CpG島常位于基因轉錄調控區附近(啟動子和第一外顯子區域), 60%的基因組編碼基因相關;

        3、人類基因組有約56MCpG位點,CpG島約4.5萬個, CpG島的數目與基因密度有良好的對應關系。

         

         

        Q2:為什么MSPI酶切率對于RRBS測序質控至關重要?

        除了類似WGBSBisufite轉化率>99%最基本的質控,RRBS還需要做好MSPI酶切富集的一致性等重要質控,而RRBS覆蓋有效深度及重疊比例與MSPI酶切率密切相關;通常MSPI酶切率要求不低于95%,最好能夠達到99%。如下圖所示,艾斯基因通過嚴格的質控,目前可以至少保證不低于95%MSPI酶切率,以滿足臨床大樣本及隊列研究對甲基化測序技術高標準要求

         

        Q3:為什么推薦強化版RRBS測序,比經典RRBS的優勢如何?

        與經典RRBS比較,強化RRBS主要是增加測序量及酶切片段寬度,以便獲得更多CpG位點甲基化信息;經典RRBS酶切片段偏小40-220bp,適用于早期的NGS測序read讀度,一般為PE50/100,例如Hiseq2000等測序儀;而強化版RRBS提高酶切片段100-350bp,更適應目前主流測序平臺PE150測序,可以獲得更多的甲基化信息。

        艾斯基因在國內率先開發和推廣了強化版RRBS測序服務,其與經典RRBS的技術指標比較如下圖所示:

         

        Q4WGBS、RRBS850K芯片在檢測覆蓋基因組范圍和準確性上的選擇?

        人和哺乳動物DNA甲基化修飾發生在CpG位點上,人基因組包含約56MCpG位點, 集中分布在CpG島、基因啟動子、增強子等甲基化調控重要的基因元件上,同時散在分布在非CpG島、基因間區、異染色質區域等。

        技術上,WGBS、RRBS850K在檢測這些CpG位點的覆蓋、偏向性和準確性有差異,如下表所示

         

        WGBS:類似突變檢測的WGS(重測序),由于WGBS比對率較低和文庫冗余比例較高,實際覆蓋基因組范圍在70%左右,有效覆蓋深度為15-20X。

        RRBS:類似突變檢測的WES(全外顯子測序),是研究基因組CpG甲基化性價比最高的方案,國內外甲基化測序服務商(Zymo Research及艾斯基因)相繼推出強化版RRBS測序,可以顯著增加基因組CG位點數量的覆蓋,尤其在增強子、CGI shore等核心區域,強化版RRBS可以覆蓋6-10M左右的CpG位點,占人基因組56MCpG位點的15%;同時有效測序深度可達50-100X,比WGBS高出很多,因此甲基化檢測準確性更高;

        850K芯片:基于甲基化分析平臺MethylationEPIC 850K BeadChip(450K芯片的增強版), 采用Oligo nucleotide雜交技術,芯片的批次效應(batch effect)有時會較嚴重,信噪比較差(來自徐瑞華主編的《腫瘤學》第五版p73-74)。850K芯片覆蓋的CpG位點主要在CpG島、啟動子及增強子等區域,設計覆蓋0.85M左右的CpG位點,占人基因組56MCpG位點的1.5%左右;450K /850K芯片在早期人基因組甲基化研究中發揮了重要作用,其主要原因是WGBSRRBS在早期測序平臺上的價格昂貴,無法滿足臨床樣本全基因組甲基化研究。但隨著WGBSRRBS測序成本下降,甲基化850K芯片的應用越來越少。

        綜上,從這3種技術檢測基因組CpG覆蓋范圍, 依次為WGBS > RRBS > 850K芯片;甲基化檢測準確性是由測序深度決定的, 依次為RRBS > WGBS > 850K芯片。

         

        Q5WGBS、RRBS850K芯片在不同甲基化研究課題中的推薦指數?

        針對不同的甲基化研究課題需求,選擇合適的技術方案!同時考慮技術的先進性、成本及研究的主要目的,對大型隊列研究、臨床樣本()及細胞系模型等研究方向,不同的推薦,如下圖所示: