氧化-重亞硫酸鹽測序 (oxBS-seq)

項目介紹

參數

常見問題

應用案例

oxBS-seq精準甲基化，單堿基分辨率

5hmC是被認為第六堿基，在發育、衰老、神經退行性疾病、復雜疾病及腫瘤發生過程中起重要作用；

并且在最近幾年5hmC已經作為一種重要癌癥篩查標志物的研究，具有重要的臨床價值；

重亞硫酸鹽測序不能區分甲基化5mC和羥甲基化5hmC，實際上是5mC和5hmC兩種修飾的混合信號；

氧化亞硫酸鹽測序，先將5hmC氧化為甲?；揎?5fC)，進而被亞硫酸鹽轉換為堿基U，實現DNA 甲基化的精準檢測；

而同時對樣本進行BS-Seq和oxBS-Seq測序則可實現對5hmC單堿基分辨率的檢測，是羥甲基化檢測的金標準方案。

核心技術及質控，用心服務每一個項目

艾斯團隊專注表觀組學10年，提供專業有價值的DNA甲基化完整解決方案；

較早開發羥甲基化測序技術的團隊，國內首家推出多種組合的oxBS-seq解決方案；

嚴格的oxBS文庫構建質控，氧化率>90%, Bisulfite轉化率>99%；

已完成多種腫瘤及哺乳動物羥甲基化測序及oxBS測序分析；

助力客戶在Genome biology, Epigenetics等雜志發表多篇論文；

專業的生物信息分析團隊, 提供更多個性化分析思路和方案。

科學方案設計

從項目方案、樣本處理、建庫測序，到數據分析；

每個項目需要專業、有價值的建議；及時高效的溝通，以保障高質量研究成果。

樣本類型和要求

樣本類型/文庫類型	樣本要求
基因組DNA (WGBS + oxWGBS)	總量≥ 5ug; 濃度≥ 50ng/ul; 基于Qubit定量
基因組DNA (RRBS + oxRRBS)	總量≥ 2ug; 濃度≥ 50ng/ul; 基于Qubit定量
基因組DNA (TBS + oxTBS)	總量≥ 1ug; 濃度≥ 50ng/ul; 基于Qubit定量
細胞、全血、新鮮冷凍組織等	按照送樣要求準備
備注：用封口膜密封樣品; 干冰運輸

信息分析

oxBS-seq	分析內容	備注
標準分析	1、測序數據質量評估	過濾掉低質量數據，保證數據質量
	2、氧化率及亞硫酸鹽轉化率評估	通過內參進行質控文庫
	3、與參考基因組比對	比對率和覆蓋度分析
	4、5mC/5hmC位點Calling	評估胞嘧啶甲基化狀態
	5、5mC/5hmC圖譜分析	5mC/5hmC在基因組、功能元件上的分布
	6、組間差異DMR/DhMR分析	尋找DMR/DhM及注釋
	7、差異5mC/5hmC基因分析	DMG富集分析GO，KEGG
	8、多樣本聚類分析	PCA分析多樣本5mC/5hmC變化規律
高級分析	9、多組學整合關聯分析	例如與轉錄組關聯分析
高級分析	10、其它定制化分析	結合課題背景亮點挖掘

案例分析1：肺癌和肝癌的全基因組甲基化和羥甲基化分析

Whole-genome analysis of the methylome and hydroxymethylome in normal and malignant lung and liver. Cell Research. 2016;26(12):1730-1741.

一、研究背景：DNA甲基化(5mC)是一種表觀遺傳修飾，在發育和疾病中調節基因表達和細胞可塑性。TET基因家族將5mC氧化為5-羥基甲基胞嘧啶(5hmC)，提供了一種主動去甲基化機制，并具有自身的調控功能。本課題應用氧化亞硫酸氫鹽測序技術，繪制肝癌和肺癌(4對肝癌+3對肺癌)全基因組范圍的單堿基分辨率的甲基化和羥甲基化圖譜，結合轉錄組測序。研究發現在組織分化和腫瘤發生過程中，通過甲基化、羥甲基化和組蛋白修飾的相互作用，存在復雜的基因表達調控。

二、方法流程

1、取材：癌及癌旁組織(4對肝癌+3對肺癌)

2、測序：全基因組氧化亞硫酸鹽測序(WGBS + oxWGBS)、轉錄組測序(RNA-Seq)

三、研究結果

1、應用氧化亞硫酸鹽測序(oxBS-seq)技術得到了正常肝臟和肺以及成對的腫瘤組織中全基因組DNA甲基化和羥甲基化圖譜;

2、研究發現, 在活躍的基因中5hmC在CpG Island shore中呈顯著富集狀態，而在CpG Island中則呈稀缺狀態;

3、啟動子、基因體和轉錄終止區域的羥甲基化分析顯示，5hmC與基因表達有很強的正相關，這表明5hmC是活躍基因的標記;

4、甲基化和羥甲基化的比較分析表明，在組織特異性DMR和癌癥特異性的DMR中，5hmC顯著地富集，而且5hmC與甲基化的變化呈負相關，特別是在非CpG Island相關的DMR中。

四、研究結論

在組織分化和腫瘤發生過程中，通過甲基化、羥甲基化和組蛋白修飾的相互作用，存在復雜的基因表達調控。

案例分析2：肝星狀細胞轉分化涉及DNA甲基化景觀的全基因組重塑

Hepatic stellate cell transdifferentiation involves genome-wide remodeling of the DNA methylation landscape. J Hepatol. 2016;64(3):661-73.

研究者采用簡化基因組氧化-亞硫酸鹽測序(RRBS/oxRRBS)檢測靜止和活體激活狀態的大鼠HSC細胞的5mC和5hmC水平，證實了5mC和5hmC在肝纖維化和HSC轉分化過程中的整體變化，表明DNA甲基化/羥甲基化是HSC激活的關鍵步驟，可能會為支持纖維生成的分子事件帶來新的見解，并可能為疾病進展提供生物標志物以及潛在的新藥物靶點。

案例分析3：中通量亞硫酸鹽測序準確檢測5mC和5hmC

Medium throughput bisulfite sequencing for accurate detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. BMC Genomics. 2017;18(1):96.

DNA的表觀遺傳修飾5mC和5hmC在發育和疾病中起著重要作用。本課題通過多重PCR靶向區域的亞硫酸鹽測序(Targeted BS-Seq, TBS)和靶向氧化-亞硫酸鹽測序(Targeted oxBS-Seq, oxTBS)，用于分析478個樣本的目標基因組區域DNA甲基化和羥甲基化水平，獲得了單堿基分辨率的5mC和5hmC數據。結果表明該方法能夠以較低的成本在大樣本中進行甲基化和羥甲基化檢測，可以廣泛用于多種科研及臨床候選基因的甲基化和羥甲基化檢測，或者用于全基因組分析后的差異甲基化和羥甲基化區域的驗證。